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蛇類飲片的PCR鑒別方法
PCR為聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction）的簡稱，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環(huán)進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。
1 簡述
1.1 本法適用于烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇飲片的PCR檢測。
1.2 本項鑒別的目的在于鑒別烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇飲片的真?zhèn)巍?/FONT>
2 儀器與用具
2.1 通用實驗室儀器設備。
2.2 PCR擴增儀
2.3 電泳系統(tǒng)
2.4 凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)
2.5離心機：轉速達到10000rpm/min
2.6 重蒸餾水儀
2.7 液氮、研缽
3 試液與材料
3.1 DNA提取試劑盒：Promega 公司Wizard SV Genomic DNA Purification System或上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式動物基因組DNA抽提試劑盒。
3.2 蛋白酶K（Proteinase K）：Promega公司或其它同類產品。
3.3 PCR反應試劑盒：包括Taq DNA聚合酶（5單位/μl）、四種脫氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液，10×PCR緩沖液（含25mmol/L Mg2+）。大連寶生物生物工程公司Takara Ex Taq或其它同類高保真DNA Taq 酶。
3.4 0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)溶液：將186.1g 二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O），加入800ml水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌。用氫氧化鈉調節(jié)溶液的pH值至8.0（約需氫氧化鈉20g），定容至1000ml。分裝后高壓蒸汽滅菌。
3.5 瓊脂糖：AgaroseI 上海生工生物工程有限公司（A0710）或其它同類產品。
3.6 電泳緩沖液：50×TAE緩沖液：稱取Tris堿242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，調節(jié)pH至8.0，定容至1000ml。使用時稀釋50倍使用。
3.7 GelRedTM核酸凝膠染色劑：Biotium 公司。GelRedä 是一種具有凝膠染色特性，并被設計為替換高毒性染色劑－溴化乙錠（EB）的紅色熒光核酸染色劑。
3.8 DNA分子量標記（DNA Molecular Weight Marker）：DNA marker（100bpDNA ladder）上海生工生物工程有限公司或其他同類產品或其它同類產品。
3.9 加樣緩沖液：稱取溴酚藍250mg，加水10ml，在室溫下過夜溶解；再稱取二甲苯腈藍250mg，用10ml水溶解；稱取蔗糖50g，用30ml水溶解，合并三種溶液，用水定容至100ml，在4℃中保存。PCR反應試劑盒中一般帶有該試劑。
3.10 引物
3.10.1金錢白花蛇引物：
5’GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3’
5’GGAATCTTATCGATATCTGATTAGTA3’
3.10.2蘄蛇引物：
5’GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3’
5’CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3’
3.10.3烏梢蛇引物：
5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’
5’CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’
3.10.4 引物溶液：引物由專業(yè)生物公司合成，純化方式為PAGE級。用無菌雙蒸水分別將上述引物稀釋到10μmol/L，開蓋前10000rpm/min離心1min。
4 模板DNA提取
采用Promega Wizard SV Genomic DNAPurification System試劑盒。
4.1 取供試品適量（約0.5g），去除表面污染物，液氮中充分研磨使成粉末，取適量（約0.1g）至1.5mL離心管中；
4.2 加入275μl消化液，比例如下：
Nuclei lysis Solution 200μl
0.5M EDTA 50μl
Proteinase K（20mg/mL） 20μl
RNaseA Solution 5μl
總體積 275μl
① 放置55℃ 水浴中溫育1hr；
② 取出后加入250μL Wizard SV Lysis Buffer，混勻后將溶液全部轉移入過濾柱中，10000rpm離心3min；
③ 棄掉過濾液，加入800μl洗脫液，10000r/min離心1min；
④ 棄掉過濾液，反復清洗3次，每次10000r/min離心1min；
⑤ 棄掉最后一次過濾液后再離心2min，將過濾柱轉移入新的離心管中，加入100μl無菌雙蒸水，室溫放置2min后10000r/min離心2min。
⑥ 濾液-20℃保存?zhèn)溆谩?/FONT>
5 PCR反應與凝膠成像分析
5.1 配制PCR反應體系
在冰上溶解10×PCR緩沖液、dNTP和引物，并配制下列反應體系。其中Taq DNA聚合酶臨用時取出，避免反復凍溶。
在200μl PCR反應管中依次加入：
10×PCR緩沖液 2.5μl
dNTP（2.5mM） 2μl
引物（10μM） 0.5μl
Taq DNA聚合酶（Takara公司，ExTaq 5U. μl-1） 0.2μl
模板（約100ng） 0.5μl
無菌雙蒸水 19.3μl
總體積 25μl
5.2 PCR反應參數(shù)
以4000r/min離心10s后，將PCR管插入PCR儀中，進行如下反應：
烏梢蛇、蘄蛇：
95℃預變性 5min
95℃ 30s
63℃ 45s
72℃后延伸 5min
金錢白花蛇：
95℃ 預變性5min
95℃ 30s
55℃ 45s
72℃后延伸 5min
PCR反應結果后，對反應產物進行電泳檢測或在4℃保存。
5.3 對照PCR的選擇和建立
在試樣PCR反應的同時，應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。
陽性對照是指用經過中國藥品生物制品檢定所鑒定的正品藥材提取的DNA作為PCR反應的模板；陰性對照是指用相應的偽品金錢白花蛇（赤練蛇），偽品烏梢蛇（灰鼠蛇）、偽品蘄蛇（眼鏡蛇）提取的DNA作為PCR反應的模板；空白對照是指用無菌雙蒸水作為PCR反應體系的DNA模板。上述對照PCR反應體系中，除模板外其余組分與5.2相同。
5.4 電泳檢測
將適量的瓊脂糖加入1×TAE緩沖液中，加熱將其溶解，配制成瓊脂糖濃度為1.5%的溶液，然后按每100ml瓊脂糖溶液中加入10μl GelRedTM溶液的比例，加入GelRedTM溶液，混勻后將其倒入制膠器中，室溫下凝固成凝膠后，取出膠板，放入盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中。在每個泳道中加入8μl的PCR產物（和2μl加樣緩沖液混合），其中一個泳道中加入DNA分子量標記，接通電源按5V/cm恒壓進行電泳20min，電泳結束后，將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。
5.5 凝膠成像分析
電泳結束后，將涼脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據DNA分子量標記判斷擴增出的目的條帶的大小，將電泳結果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。
6結果判斷
在陰性對照和空白未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預期大小的擴增條帶情況下，如試樣出現(xiàn)相應大小擴增帶則可判定該試樣為陽性結果。
烏梢蛇：300～400之間（350bp）
蘄蛇：200～300之間（291bp）
金錢白花蛇：500～600bp之間（507bp）
如待測樣品未出現(xiàn)相應大小的擴增條帶，則該樣品可判斷為偽品。 |
